生物活性肽制备纯化和分析的研究进展(2)

液态发酵分为单菌发酵和复合菌种发酵两种。单菌发酵是细菌或真菌液态发酵，复合菌发酵是真菌和细菌的混合发酵。混合菌种发酵具有细菌和真菌的双重优点，产生的蛋白酶酶活强，而且酶系丰富，使发酵更迅速、更彻底。因此，复合菌液态发酵制备生物活性肽非常有研究价值。与固态发酵相比，液态发酵有发酵周期短，生产效率高，菌种生长状况好等优点，适合大规模工业化生产[12]。盖梦和张美莉[13]用液态发酵法制备燕麦 ACE 抑制肽，在发酵时间 39 h，初始 pH 9，发酵温度 34 ℃ 的条件下验证 ACE 抑制率为63.96%。李爱晨[14]在 32 ℃，pH 7，料液比为 4% 的条件下液态发酵黑曲霉和米曲霉混合菌种 48 h 制备米糠肽，肽转化率达到 59.86%。相对于固态发酵法，液态发酵法便于实时观测实验现象和进度，更有利于控制米糠肽的转化率。Torino 等[15]比较了固态和液态发酵小扁豆获得的水溶性提取物的生物活性，结果显示，液态发酵的水溶性提取物含较多总酚和抗氧化物，在抗高血压的治疗上有广阔前景。

1.2 发酵法的优势

相对于酶解法，微生物发酵的过程中能够产生多种蛋白酶，有效避免了单一酶类水解不完全的问题；同时，快速繁殖和高产的菌类替代了酶解中的纯化过程，有效降低了生产成本。在生产过程中无需附加条件，不会给产品带来过多的无机盐成分，同时植物原料的发酵副产品可用作饲料，有效避免浪费。微生物发酵的另一个优势在于可以对某些苦味肽基团进行修饰和重组，获得的活性肽能达到基本无苦味，可以有效运用到保健食品领域[16]。在微生物发酵过程中添加酵母菌、乳酸菌或醋酸杆菌等有益菌，可产生有香味的有机酸，从而改善发酵产物的风味。

微生物发酵的原材料富含蛋白质，例如乳制品、大豆、米糠等，通过控制不同的发酵条件，以可食用的动植物蛋白做发酵原料，生产出多种安全可靠的生物活性肽类。正所谓“药食同源”，这些活性肽更有利于人体消化和吸收，具有广阔的应用前景。

1.3 发酵菌株的选择

微生物发酵常用的菌株有芽孢杆菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉、乳酸菌等。下文就几种发酵效率高的菌株进行详细论述。

1.3.1 芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是碱性蛋白酶的主要生产菌，但地衣芽孢杆菌的分泌能力是枯草芽孢杆菌的 2 倍，且地衣芽孢杆菌生长缓慢，能够使分泌出的蛋白充分折叠和运输[17]。

有实验证明，通过重组地衣芽孢杆菌的 DNA 来实现碱性蛋白酶高分泌量，并缩短发酵周期而制备出高纯度的酪蛋白磷酸肽[4]。王文平[18]发酵豆粕制备大豆活性肽，证明枯草芽孢杆菌的蛋白水解能力要优于米曲霉、黑曲霉和酵母菌，且枯草芽孢杆菌的单菌水解度要高于混合菌。管国强等[19]以大豆肽转化率为指标，优化了枯草芽孢杆菌 ZC1 发酵豆粕制备大豆肽的工艺条件。在料液 pH 5.42、碳源含量1.73%、发酵时间 43.45 h 的条件下发酵羊胎盘下脚料制备的免疫活性肽对小鼠淋巴细胞的促增殖作用显著[20]。

1.3.2 米曲霉与黑曲霉 米曲霉是生产蛋白酶的优良菌种，米曲霉在生长过程中分泌的蛋白酶的活性高低受到其利用的物料以及生产环境的影响[21]。黑曲霉所产生的酸性蛋白酶是具有良好热稳定性和金属离子稳定性的端肽酶[11]。

比较枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉发酵羊胎盘残留物制备的活性肽，证明黑曲霉的发酵产物多肽含量最高，且抗氧化性能最好，在相同胎盘肽质量浓度 100 μg/ml 下，黑曲霉的免疫细胞刺激指数达到 24.89%[22]。武金霞等[23]利用米曲霉发酵蝇蛆蛋白，获得质量浓度为 7.9 mg/ml、肽转化率为 31.6% 的蝇蛆肽，经 SDS-PAGE 检测其分子质量为4.3～65.9 kD。

1.3.3 乳酸菌 国外学者通常利用乳制品发酵制备生物活性肽。乳酸菌的蛋白水解系统主要有：将酪蛋白水解成寡肽的酶类；转运寡肽的特殊蛋白；以及进一步水解寡肽的胞内肽酶[24]。类似乳酸菌的研究还包括嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等，它们高效的蛋白质水解系统均有利于活性肽的释放。张奕[25]利用10 种乳酸菌和 4 种酵母菌发酵驼乳制备免疫活性肽。在制备大米蛋白 ACE 抑制肽中，乳酸菌的脱蛋白能力要明显优于芽孢杆菌，且乳酸菌与胃蛋白酶、菠萝蛋白酶的组合脱除率最高达到 91%[26]。

1.3.4 复合菌 微生物通过自身生理活动产生多种功能的肽酶谱系，这些酶类将发酵产物中的基团修饰和重组，让肽段之间或与氨基酸之间进行重组，进而改善多肽的功能和特性。不同微生物内存在不同的蛋白酶系，产酶的种类与数量会随着生产条件的不同而发生改变。不同的菌种有不同的发酵效果，根据各菌种的生长条件和生理特性来选择最优的发酵条件，可以充分发挥其发酵优势。例如用于花生粕发酵时，枯草芽孢杆菌多用于液态发酵，而霉菌多用于固态发酵，近些年用混合菌种固态发酵花生粕制备生物多肽的案例有很多[27]。

文章来源：《现代科学仪器》 网址: http://www.xdkxyq.cn/qikandaodu/2021/0418/447.html