生物活性肽制备纯化和分析的研究进展(4)

MALDI-TOF-MS 的工作机制是在质谱系统的基础上进行了优化。MALDI 是在 1987年后正式确立的一种软电离方法，“软电离”就是指用较低的能量使分子电离。样品与基质形成共结晶后，吸收了脉冲激光中的部分能量而发生解吸，使样品离子化[44]。基质的作用就是分散样品分子，有利于把从激光中吸收的大部分能量快速传递给样品，促进样品离子化。

飞行时间质谱（TOF-MS）是一个真空的无场离子漂移管，当离子加速后进入漂移管，会以恒定的速度飞向离子接收器，接收器就会通过离子的质荷比与飞行时间所成的正比来测定样品的分子量。

3.2 MALDI-TOF-MS 分析生物活性肽的优势与应用前景

由于 MALDI-TOF-MS 使用的是软电离技术，使得样品分子在电离过程中不会破坏其结构，保证分子的完整性。在保证使用合适的基质时，理论的检测范围很宽，从 40 ～400 kD[45]，同时只需要很少的样品量就能够保证检测的灵敏度。MALDI-TOF 的优越性还体现在通过图谱能够直观地得到样品分子的质量，同时也可以得到高分子的末端基结构信息等。

在分析蛋白质结构的方法中，高效液相色谱（HPLC）或十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- PAGE）是相对较成熟和有效的手段。随着质谱手段的发展，曾有研究人员比较了几种新型质谱技术，认为 MALDI 的灵敏度高，抗干扰能力强[46]。

孙宜君[47]采用 MALDI-TOF/TOF-MS 以及 LTQ 串联质谱的方法对螺旋藻抗菌肽 SP-1 的结构进行分析鉴定，最终确定 SP-1 为 18 个氨基酸（KLVD ASHRLATGDVAVRA）组成的阳离子小分子肽，分子量约为 1878.97 D。另有学者用 MALDI-TOF-MS 对羊胎盘抗氧化肽进行结构鉴定和氨基酸序列测定，得到一种由六个氨基酸组成的新肽，序列为Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe，相对分子量为 678.6[48]。也有研究利用该方法鉴定坛紫菜活性肽，其中 M/Z = 的多肽氨基酸序列为 QTDDNHSNVLWAGFSR，另外两个质荷比为 1280.676 和 1677.879 的多肽序列分别为VPGTPKNLDSPR 和 MPAPSCALPRSVVPPR[49]。

4 展望

生物活性肽的研究发展迅猛，可见其功能的优越性以及人们需求的迫切性。但目前活性肽的研究还驻足在实验室阶段，研究人员需要利用更先进的手段来提取、纯化和鉴定各类多肽。为了能达到商业化生产和大批量供应，需要用临床试验数据来证明活性肽的功效，以及如何保证在人体内发挥效用而不被其他物质影响，同时还需要优化产品嗅味。这些都是我们今后进行攻关的目标，生物活性肽的发展是机遇和挑战并存的。

生物活性肽具有特殊的生理特性，其在医药和保健食品领域的研究已成为热点。现代科学发展不仅要求能够分离得到具有不同功能的活性肽类，更重要的是能够经过进一步纯化和鉴定得到准确的肽结构、氨基酸序列以及功能通路。

生物活性肽分子质量小但活性显著，主要根据不同的氨基酸的排列顺序而表现出抗氧化、清除自由基、免疫调节、抗癌、抑制病毒等特性[1]。生物体内的活性肽是蛋白质长链经过一定程度的水解之后，将非活性的短肽释放出来，形成的有特殊功能的活性物质[2]。但是，从天然物质中提取活性肽却十分困难，通常每毫克组织中能够有效提取的肽含量很低，又受到原材料来源和分离方法的限制，因此，迫切地需要有效的分离提取、纯化和鉴定的技术来发现和获得更多的生物活性肽。

生物活性肽的制备方法通常有：酶法、微生物发酵法、生物合成法以及基因重组法等。提取纯化的方法有：膜分离技术、层析技术、电泳技术、色谱技术以及探针分离法等；同时还会将多种方法进行联用，以期获得更加单一和结构清晰的活性肽，例如高效液相色谱与质谱联用。利用不同的分离技术获得的生物活性肽均显示出较好的生物学作用。通过小鼠负重游泳试验证明，利用木瓜蛋白酶酶解林蛙油制备的生物活性肽能够有效缓解疲劳[3]。凌敏等[4]研究发现，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均是碱性蛋白酶的生产菌，但地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌具有更强的分泌碱性蛋白酶的能力。通过重组 DNA 实现嗜碱性芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶在地衣芽孢杆菌中的分泌表达，能够提高表达量，并缩短发酵周期。色谱和质谱联用可同时实现单一组分的分离和氨基酸序列的鉴定，在现实中得到广泛应用。Puchalska 等[5]采用高效液相-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术（HPLC-ESI-Q-TOF）提取到亮氨酰-丝氨酰-脯氨酸、亮氨酰-谷氨酰胺酰-脯氨酸和亮氨酰-精氨酰-脯氨酸 3 种玉米抗压肽。Zhao 等[6]利用超滤和连续色谱分离纯化鹿茸得到4 种具有抗炎作用的活性肽，并用液相色谱串联质谱进行肽结构的鉴定。

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