生物活性肽制备纯化和分析的研究进展(3)

张吉鹍[28]曾提出利用多菌种组合固态发酵法生产大豆肽蛋白饲料。有研究显示，以黑曲霉与枯草芽孢杆菌 1∶1.5的比例共生发酵甘薯蛋白 48 h，制备的活性肽产量高[29]。王玮[30]利用米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母组合发酵花生粕制备抗氧化肽，证明米曲霉和酵母菌以 1.4∶1的比例发酵效果最佳。

复合菌种的发酵虽然具有很多优点，但是不同菌种之间存在相互拮抗作用，可以通过控制菌种的比例和添加量来降低这种作用。另外，高产菌种的筛选仍需要继续深入探索和研究。

2 亲水作用色谱分离提取生物活性肽

1990年，美国科学家 Alpert 首次提出了亲水作用色谱（HILIC）的概念[31]，但早在 20 世纪 50年代，亲水作用色谱就有使用的记录，直到 2000年前后该方法得到了广泛的应用。

2.1 亲水作用色谱的应用原理

亲水作用色谱是液相色谱中的一种，是亲水基质分离的有效手段，随着固定相和溶质的极性增加，而有机溶剂的极性减小来实现分离，与反向液相色谱的原理相反[32]。

亲水作用色谱利用强极性的固定相结合不同比例的有机相与水组成的流动相来实现对强极性化合物保留的目的。亲水性的固定相表面附着一层富水层，富水层与贫水的流动相形成一个液/液萃取的系统，溶质通过这个萃取系统实现保留。

亲水作用色谱的固定相是与水有较好亲和性的强极性基团。其中，氨基键合相是较早用于亲水作用色谱的固定相，对碳水化合物有良好的分离选择性[33]。硅胶是最早应用于亲水色谱的固定相，其具有良好的质谱兼容性[34]。酰胺键合相和聚（琥珀酰亚胺）型键合相具有很好的亲水性和独特的分离选择性，被广泛用于多肽的分离，在蛋白质组学中发挥重要的作用。两性离子键合相表面的正负官能团具有良好的亲水性，同样在蛋白质组学中有良好的应用[35]。

另外，亲水色谱的流动相是乙腈-水或挥发性缓冲盐溶液体系，水相的比例最高达到 60%，是为了能够保证固定相颗粒被充分地润湿并保持亲水作用[36]。流动相的种类和有机溶剂的含量都会对溶质的保留产生影响，在流动相中，必须有一定比例的有机溶剂方能体现出溶质与固定相的亲水作用。有时流动相中的有机溶剂与水分的组成已不能满足色谱的分离效果，有人考虑用盐来调节流动相的浓度，如甲酸铵、乙酸铵等[37]。

2.2 亲水作用色谱分离生物活性肽的优势与应用前景

亲水作用色谱不仅能够分离少于 5 个氨基酸的寡肽，而且也是一种定量定性分析的手段。流动相中的高浓度有机溶剂可以增强电喷雾离子源质谱的离子化效率，从而提高检测的灵敏度，与质谱具有很好的兼容性。

亲水色谱在分离提取氨基酸上已有成熟的应用。氨基酸在两性离子状态下，其羧基基团可发生电离被质子化，因此两性离子固定相常用于氨基酸的分离、纯化[38]。Pan 等[39]采用 HILIC-UPLC-MS/MS 法对 10 个板蓝根样品中的22 种游离氨基酸进行了分析，并取得了较好的分离效果。Yao 等[40]使用亲水作用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用（HILIC-UPLCESI-MS/MS）对银杏叶中 22 种游离氨基酸进行分离。

氨基酸成分的成熟应用能够为多肽、蛋白质成分的分离和鉴定奠定基础。Xu 等[41]采用 2D-RPLC/HILIC 对全蝎的蝎毒成分中肽类进行分割及纯化，并通过 MS 的方法进行结构鉴定，命名了两种新肽，为肽类的研究提供了新的依据。Zhou 等[42]采用 HILIC-UHPLC-QTRAP?/MS2 联合化学计量学的方法对罗汉果中的 27 种游离氨基酸、二肽和三肽类化合物进行了分析。但是，由于亲水作用色谱的保留机制尚没有统一定论，复杂的交互作用都可能对峰型有很大的影响。由于出峰次序与反向色谱不同，运用亲水色谱分离氨基酸或多肽时，其中某些有机溶剂可能会影响蛋白质的溶解度或性状。所以确定必要参数对保留化合物非常重要。

3 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析生物活性肽

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是一种软电离质谱技术，其具有高灵敏度和高精确度等特点，为生命科学的研究提供强有力的技术支持。

2002年诺贝尔化学奖得主田中耕一（日）和约翰·贝内特（美）进一步发展了软电离法对生物大分子的鉴定和结构分析。

3.1 MALDI-TOF-MS 的应用原理

质谱的基本结构是离子源、质量分析器、离子检测器、数据分析和质谱谱图五个部分。其工作原理是将样品在离子源中电离，形成不同质荷比（M/Z）的离子，经电场加速进入质量分析器；在电场或磁场作用下，离子从质量分析器运行至离子检测器，经数据分析后绘出质谱图[43]。

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