生物活性肽制备纯化和分析的研究进展(5)

随着技术的进步，科研水平的完善以及人类需求的扩大，生物活性肽的制备、纯化和鉴定的方法已不局限于一种或几种方法，而是将多种高效的手段串联起来发挥更全面的作用。但是无论使用何种方法制备得到的肽产物其实是包含杂质的混合物，在进行必要的分离纯化后，得到的产物依然存在糖类、盐类及水分等物质。肽的制备和应用受到多种因素的制约，为得到其中有效组分，各种方法也在不断更新和进步，笔者从健康和高效的角度出发，筛选出制备、纯化和分析生物活性肽的有效方法供大家参考。

1 发酵法制备生物活性肽

制备生物活性肽的方法主要有酶解法、发酵法和定向合成法等几种。酶解法条件温和、快捷、安全、过程易控制。蛋白质经过预处理可提高酶对蛋白质的敏感性，酶解技术可控制酶切位点，保证产物一定的分子质量。其局限性在于必须选择合适的酶和确定所需的时间、温度、pH 等条件[7]。定向合成法包括：液相法、固相法、酶法合成及 DNA 重组等，其中液相法适合小肽合成；DNA 重组使活性肽的产量和纯度提高。但液相法不适合用于反应中间体溶解度低的情况；固相合成限于 40～200 个氨基酸[8]。而发酵法制备活性肽的优势在于生产的活性肽多来源于食品，更安全，可同时利用微生物降低或消除苦味。制备的关键是发酵菌株的选择。

1.1 发酵法的应用原理

微生物发酵工艺根据底物的不同分为液态发酵和固态发酵两种，其基本原理是利用菌种在其代谢过程中产生的蛋白酶，将活性肽片段从底物蛋白中水解出来，实现对发酵产品的分离纯化[9]。

固态发酵是先选择合适的菌种进行扩大培养后得到产量大、活性好、抗杂菌能力强的发酵基团。将经过灭菌和调制的预处理原料与发酵基团混合，进入发酵生产过程。固态发酵是需氧发酵，物料厚度要适当和均匀，保证通风透气；而且发酵的过程中会产生热量，需要经常翻动来蒸发水分。固态发酵的不足之处在于发酵过程需要接触外界空气，容易受到杂菌的污染。因此需根据不同菌种的特性，提供足够的营养和条件，使菌母形成绝对的生长优势，从而抑制杂菌。曹亚兰[10]分别利用固态发酵和酶解偶联制备大豆抗氧化活性肽，结果证明发酵法制备的大豆肽比酶解法制备的肽具有更高的抗氧化能力。许芳等[11]利用混合菌类固态发酵水解脱脂大豆粉制备活性肽，水解度可达到 90.61%。

液态发酵分为单菌发酵和复合菌种发酵两种。单菌发酵是细菌或真菌液态发酵，复合菌发酵是真菌和细菌的混合发酵。混合菌种发酵具有细菌和真菌的双重优点，产生的蛋白酶酶活强，而且酶系丰富，使发酵更迅速、更彻底。因此，复合菌液态发酵制备生物活性肽非常有研究价值。与固态发酵相比，液态发酵有发酵周期短，生产效率高，菌种生长状况好等优点，适合大规模工业化生产[12]。盖梦和张美莉[13]用液态发酵法制备燕麦 ACE 抑制肽，在发酵时间 39 h，初始 pH 9，发酵温度 34 ℃ 的条件下验证 ACE 抑制率为63.96%。李爱晨[14]在 32 ℃，pH 7，料液比为 4% 的条件下液态发酵黑曲霉和米曲霉混合菌种 48 h 制备米糠肽，肽转化率达到 59.86%。相对于固态发酵法，液态发酵法便于实时观测实验现象和进度，更有利于控制米糠肽的转化率。Torino 等[15]比较了固态和液态发酵小扁豆获得的水溶性提取物的生物活性，结果显示，液态发酵的水溶性提取物含较多总酚和抗氧化物，在抗高血压的治疗上有广阔前景。

1.2 发酵法的优势

相对于酶解法，微生物发酵的过程中能够产生多种蛋白酶，有效避免了单一酶类水解不完全的问题；同时，快速繁殖和高产的菌类替代了酶解中的纯化过程，有效降低了生产成本。在生产过程中无需附加条件，不会给产品带来过多的无机盐成分，同时植物原料的发酵副产品可用作饲料，有效避免浪费。微生物发酵的另一个优势在于可以对某些苦味肽基团进行修饰和重组，获得的活性肽能达到基本无苦味，可以有效运用到保健食品领域[16]。在微生物发酵过程中添加酵母菌、乳酸菌或醋酸杆菌等有益菌，可产生有香味的有机酸，从而改善发酵产物的风味。

微生物发酵的原材料富含蛋白质，例如乳制品、大豆、米糠等，通过控制不同的发酵条件，以可食用的动植物蛋白做发酵原料，生产出多种安全可靠的生物活性肽类。正所谓“药食同源”，这些活性肽更有利于人体消化和吸收，具有广阔的应用前景。

文章来源：《现代科学仪器》 网址: http://www.xdkxyq.cn/qikandaodu/2021/0418/447.html