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生物活性肽制备纯化和分析的研究进展(7)

来源:现代科学仪器 【在线投稿】 栏目:期刊导读 时间:2021-04-18
作者:网站采编
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摘要:另外,亲水色谱的流动相是乙腈-水或挥发性缓冲盐溶液体系,水相的比例最高达到 60%,是为了能够保证固定相颗粒被充分地润湿并保持亲水作用[36]。流动

另外,亲水色谱的流动相是乙腈-水或挥发性缓冲盐溶液体系,水相的比例最高达到 60%,是为了能够保证固定相颗粒被充分地润湿并保持亲水作用[36]。流动相的种类和有机溶剂的含量都会对溶质的保留产生影响,在流动相中,必须有一定比例的有机溶剂方能体现出溶质与固定相的亲水作用。有时流动相中的有机溶剂与水分的组成已不能满足色谱的分离效果,有人考虑用盐来调节流动相的浓度,如甲酸铵、乙酸铵等[37]。

2.2 亲水作用色谱分离生物活性肽的优势与应用前景

亲水作用色谱不仅能够分离少于 5 个氨基酸的寡肽,而且也是一种定量定性分析的手段。流动相中的高浓度有机溶剂可以增强电喷雾离子源质谱的离子化效率,从而提高检测的灵敏度,与质谱具有很好的兼容性。

亲水色谱在分离提取氨基酸上已有成熟的应用。氨基酸在两性离子状态下,其羧基基团可发生电离被质子化,因此两性离子固定相常用于氨基酸的分离、纯化[38]。Pan 等[39]采用 HILIC-UPLC-MS/MS 法对 10 个板蓝根样品中的22 种游离氨基酸进行了分析,并取得了较好的分离效果。Yao 等[40]使用亲水作用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用(HILIC-UPLCESI-MS/MS)对银杏叶中 22 种游离氨基酸进行分离。

氨基酸成分的成熟应用能够为多肽、蛋白质成分的分离和鉴定奠定基础。Xu 等[41]采用 2D-RPLC/HILIC 对全蝎的蝎毒成分中肽类进行分割及纯化,并通过 MS 的方法进行结构鉴定,命名了两种新肽,为肽类的研究提供了新的依据。Zhou 等[42]采用 HILIC-UHPLC-QTRAP?/MS2 联合化学计量学的方法对罗汉果中的 27 种游离氨基酸、二肽和三肽类化合物进行了分析。但是,由于亲水作用色谱的保留机制尚没有统一定论,复杂的交互作用都可能对峰型有很大的影响。由于出峰次序与反向色谱不同,运用亲水色谱分离氨基酸或多肽时,其中某些有机溶剂可能会影响蛋白质的溶解度或性状。所以确定必要参数对保留化合物非常重要。

3 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析生物活性肽

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是一种软电离质谱技术,其具有高灵敏度和高精确度等特点,为生命科学的研究提供强有力的技术支持。

2002年诺贝尔化学奖得主田中耕一(日)和约翰·贝内特(美)进一步发展了软电离法对生物大分子的鉴定和结构分析。

3.1 MALDI-TOF-MS 的应用原理

质谱的基本结构是离子源、质量分析器、离子检测器、数据分析和质谱谱图五个部分。其工作原理是将样品在离子源中电离,形成不同质荷比(M/Z)的离子,经电场加速进入质量分析器;在电场或磁场作用下,离子从质量分析器运行至离子检测器,经数据分析后绘出质谱图[43]。

MALDI-TOF-MS 的工作机制是在质谱系统的基础上进行了优化。MALDI 是在 1987年后正式确立的一种软电离方法,“软电离”就是指用较低的能量使分子电离。样品与基质形成共结晶后,吸收了脉冲激光中的部分能量而发生解吸,使样品离子化[44]。基质的作用就是分散样品分子,有利于把从激光中吸收的大部分能量快速传递给样品,促进样品离子化。

飞行时间质谱(TOF-MS)是一个真空的无场离子漂移管,当离子加速后进入漂移管,会以恒定的速度飞向离子接收器,接收器就会通过离子的质荷比与飞行时间所成的正比来测定样品的分子量。

3.2 MALDI-TOF-MS 分析生物活性肽的优势与应用前景

由于 MALDI-TOF-MS 使用的是软电离技术,使得样品分子在电离过程中不会破坏其结构,保证分子的完整性。在保证使用合适的基质时,理论的检测范围很宽,从 40 ~400 kD[45],同时只需要很少的样品量就能够保证检测的灵敏度。MALDI-TOF 的优越性还体现在通过图谱能够直观地得到样品分子的质量,同时也可以得到高分子的末端基结构信息等。

在分析蛋白质结构的方法中,高效液相色谱(HPLC)或十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE)是相对较成熟和有效的手段。随着质谱手段的发展,曾有研究人员比较了几种新型质谱技术,认为 MALDI 的灵敏度高,抗干扰能力强[46]。

孙宜君[47]采用 MALDI-TOF/TOF-MS 以及 LTQ 串联质谱的方法对螺旋藻抗菌肽 SP-1 的结构进行分析鉴定,最终确定 SP-1 为 18 个氨基酸(KLVD ASHRLATGDVAVRA)组成的阳离子小分子肽,分子量约为 1878.97 D。另有学者用 MALDI-TOF-MS 对羊胎盘抗氧化肽进行结构鉴定和氨基酸序列测定,得到一种由六个氨基酸组成的新肽,序列为Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe,相对分子量为 678.6[48]。也有研究利用该方法鉴定坛紫菜活性肽,其中 M/Z = 的多肽氨基酸序列为 QTDDNHSNVLWAGFSR,另外两个质荷比为 1280.676 和 1677.879 的多肽序列分别为VPGTPKNLDSPR 和 MPAPSCALPRSVVPPR[49]。

文章来源:《现代科学仪器》 网址: http://www.xdkxyq.cn/qikandaodu/2021/0418/447.html



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